当高效液相色谱法测定大鼠海马胆固醇

高效液相色谱法测可分为静负荷实验机和动负荷实验机定大鼠海马胆固醇

关键词: 高效液相色谱法L;胆固醇;大鼠海马;紫外检测器

摘要:胆固醇不仅在动脉粥样硬化等心血管疾病的发生发展中至关重要，而且在中枢神经系统的发育和功能活动中起着关键性作用［1］. 本资料用相对简单的高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)法测定了不同发育时期的大鼠海马胆固醇含量.

1材对产品的技术要求包括原料要求、感官要求、理化指标和添加剂要求4个部份料和方法

1.1材料

湖北省医学科学院实验动物中心提供健康雄性Wistar乳鼠（出生24 h内）、幼鼠（28~30 d，体质量40~60 g）和成鼠（90~100 d， 体质量200~250 g）各10只. 乙腈、异丙醇、无水乙醇等都为色谱纯试剂,标准胆固醇(HPLC级)为美国Sigma公司产品. VARIAN Prostar 210高效液相色谱仪 (美国VARIAN公司生产),配置Prostar 210高压泵、VARIAN Prostar 500柱温箱、手动进样器.

1.2方法

1.2.1组织样品制备将大鼠快速活杀断头取海马称质量,按10 mL/g加无水乙醇在冰台上磨成匀浆,在20 600 g, 4℃离心2次，每次20 min,将上清液以0.45 μm的微孔滤膜滤过, 取滤液分装, -70℃保存待测.

1.2.2配制标准溶液和测定胆固醇标准胆固醇储备液(1 g/L):准确称取胆固醇66.18 mg溶于25 mL的无水乙醇中. 标准胆固醇工作液:取标准胆固醇储备液,分别以无水乙醇稀释使其浓度分别为0.1323, 0.26472, 0.6618, 1.3236, 2.6472 g/L. 美国安捷伦公司反相色谱柱(ZORBAX XDB C18 4.6*250 mm 5 μm, Agilent), 柱温38℃, 乙腈异丙醇(4∶1, V/V)为洗脱流动相对标准储备液和样品中胆固醇进行分离洗脱. 流速:0.8 mL/min;检测波长:208 nm;进样量:20 μL,Varian Prostar 325紫外检测器和美国Varian公司的LC Workstation V6.2色谱数据处理系统检测和处理色谱数据,获得胆固醇色谱图. 计算结果：X=10×0.9965×A×B÷CX: 样品中胆固醇的含量(mg/g). A: 样品中胆固醇的峰面积. 10: 样品稀释倍数(mL/g). B: 标准胆固醇的含量(g/L). C: 标准胆固醇的峰面积. 0.9965: 胆固醇标准品纯度.

统计学处理： 数据用x±s表示, 变量间比较用F检验.

2结果

2.1标准工作曲线在选择的色谱条件下,胆固醇的保留时间为13~15 min. 以胆固醇浓度分别为0.1323, 0.26472, 0.6618, 1.3236和2.6472 g/L的标准胆固醇工作液重复上样(重复3次),上样量为20 μL,以峰面积为纵坐标Y, 胆固醇浓度为横坐标X(g/L)，进行线性回归, 得到线性回归方程为:Y=837148.3+X, 相关系数r=0.99993，P 0.01. 最低检测限为10 mg/L.

2.2回收率准确称取已知含量(12.8 mg/g)的样品0.1 g(精确至0.0002 g) ,准确加入1 mL浓度为1.3236 g/L的胆固醇标准品溶液. 按上述方法制备组织样品后加无水乙醇做平行样5个，测定胆固醇含量. 平均回收率为99.94%.

2.3精密度取浓度为1.3236 g/L的胆固醇标准品溶液,连续进样5次,测定结果表明其变异系数为1.2%.

2.4样品中胆固醇含量乳鼠、幼鼠和成鼠海马样品胆固醇色谱图. 胆固醇都在相同的保留时间被洗脱出来，其含量分别为2.92±0.03,11.20±1.41,12.91±1.25(mg/g), 经F检验和两两比较，相互间差别有极显著性意义（P 0.01）.

3讨论

我们用紫外检测器得到胆固醇最低检测限达10 mg/L，回收率和精密度均高. 故此法灵敏，结果准确、可靠，对临床和科研很有价值.

Mauch等［1］确定glia因子为胆固醇与载脂蛋白E复合形成的脂蛋白. 胆固醇对大鼠海马的发育和成熟的作用报道甚少［2,3］. 我们推测，在大鼠发育过程中，海马胆固醇含量渐增, 胆固醇对大鼠海马发育和成熟可能发挥了重要作用［4］.

【参考文献】

［1］ Mauch DH, Negler K, Schumaker S, et al. CNS synaptoge”同时nesis promoted by glialderived cholesterol［J］. Science, 2001; 294: .

［2］ 申军现,金卫林,鞠躬. 低密度体外培养大鼠海马神经元的形态学观察［J］.第四军医大学学报, 2003; 24(6)： .

［3］ 雷革胜，万业宏，王玉英，等. 应用红外可视脑片膜片钳技术研究大鼠海马CA1区神经元的电生理特性［J］. 第四军医大学学报,2004;25(13):.

［4］ Hayashi H, Campeno已开发出静态拉压、静态改变、高频拉压疲劳、低t RB, Vance DE, et al. Glial lipoproteins stimulate axoGrowth of central nervous system neurons in compartmented cultures［J］. J Biol Chem, 2004; 14(279):.